Wie pflanzliche Enzyme zwischen zwei spiegelbildlichen Molekülformen unterscheiden

Chirale niedermolekulare Verbindungen wie Menthol oder Limonen besitzen trotz nahezu identischer physiko-chemischer Eigenschaften oft ausgeprägte Unterschiede in ihrer Geruchs-, Geschmacks- oder pharmakologischen Wirkung. Biotechnologisch sind daher Enzyme von Interesse, die als Biokatalysatoren enantioselektive Transformationen mit hoher Präzision durchführen. Wie sich diese Enantioselektivität im Laufe der natürlichen Evolution herausgebildet hat, rekonstruierte ein Forschungsteam der Freien Universität Berlin, der Technischen Universität Graz und des Georgia Institute of Technology am Modell pflanzlicher Borneol-Dehydrogenasen (BDH), die das Bicyclo-Monoterpenoid Borneol zu Campher oxidieren.

Rekonstruktion ancestraler Enzymstrukturen

Borneol tritt in zwei Enantiomeren auf. Während einige BDH-Isotypen ausgeprägte Substratspezifitäten für ein Enantiomer zeigen, reagieren andere weitgehend unselektiv. Das Team um Dr. Bernhard Loll, Prof. Dr. Robert Kourist und Prof. Lynn Kamerlin untersuchte die evolutionären Mechanismen dieser Differenzierung durch phylogenetische Rekonstruktion ancestraler Sequenzen aus 97 rezenten pflanzlichen BDHs sowie deren anschließender heterologer Expression und biochemischer Charakterisierung.

„Wir konnten zeigen, wie sich die unterschiedliche Reaktion auf die beiden Borneol-Formen im Laufe der Entwicklungsgeschichte der Enzyme herausgebildet haben kann. Entscheidend ist dabei nicht eine große Veränderung der Form des Enzyms, sondern das Zusammenspiel vieler kleiner Veränderungen, die beeinflussen, wie sich das Enzym und das gebundene Molekül bewegen. Das liefert zugleich wichtige Hinweise dafür, wie sich Enzyme künftig gezielt für biotechnologische Anwendungen verändern lassen“, erklärt Dr. Bernhard Loll. Der funktionelle Vergleich zeigte, dass eine geographisch/evolutionär sehr alte Form (N30) beide Borneol-Enantiomere mit vergleichbarer Effizienz umsetzt. Die jüngere Evolutionsstufe (N32) zeichnet sich hingegen durch eine hohe Enantioselektivität aus. Beide Proteine unterscheiden sich in 19 Aminosäurepositionen.

Einfluss distant positionierter Aminosäurereste

Eine dieser Aminosäuresubstitutionen befindet sich direkt im aktiven Zentrum des Enzyms. Der gezielte Austausch dieser Aminosäure im Ahnenprotein N30 verdoppelte die Stereoselektivität; die Reversion in N32 führte zum Verlust der Enantioselektivität. Erst die Kombination mit drei weiteren Aminosäuresubstitutionen an Positionen außerhalb des katalytischen Zentrums führte jedoch zur vollständigen Ausprägung der hohen Enantioselektivität des N32-Typs. Dies belegt, dass auch zur katalytischen Triade distant gelegene Proteinbereiche die Enantioselektivität maßgeblich über allosterische oder dynamische Effekte steuern.

Katalytische Dynamik statt statischer Strukturänderung

Röntgenkristallographische Vergleiche der ancestralen Enzyme zeigten kaum statische Konformationsunterschiede. Molekulardynamik-Simulationen offenbarten jedoch entscheidende mechanistische Unterschiede in den Enzym-Substrat-Komplexen.

• Bevorzugtes Enantiomer: Verbleibt thermodynamisch stabil und langzeitig in einer für den Hydridtransfer optimalen Orientierung im aktiven Zentrum.
• Weniger bevorzugtes Enantiomer: Weist eine verringerte Bindungsaffinität auf, verlässt die reaktive Konformation häufiger und ist stärker solventexponiert.

Die Enantioselektivität basiert folglich nicht auf einer großflächigen Restrukturierung der Bindungstasche, sondern auf feinstrukturellen Feinabstimmungen der Proteindynamik über multiple Aminosäuresubstitutionen.

Relevanz für das Enzym-Engineering

Borneol und Isoborneol lassen sich aus α-Pinen gewinnen, einem kostengünstigen Edukt aus erneuerbaren Ressorcen. Enantioselektive BDHs sind daher wertvolle Werkzeuge zur Trennung racemischer Gemische oder zur gezielten Synthese optisch reiner Zwischenprodukte für die Pharmaka-, Kosmetik- und Duftstoffindustrie. Für das Protein Engineering zeigt die Studie, dass Rational Design nicht auf die unmittelbare Bindungstasche beschränkt bleiben darf. Die Berücksichtigung flexibler Schleifen und entfernt liegender Aminosäurereste ist essenziell, um die Konformationsdynamik und Selektivität maßgeschneidert zu optimieren.

Quelle

Freie Universität Berlin (10/2026)