Neue Markierungsmethode liefert umfassenden Einblick in zelluläre Prozesse

Ein internationales Forschungsteam unter der Leitung der Universitätsmedizin Göttingen (UMG) hat eine fortschrittliche Markierungsmethode zur hochdimensionalen Proteinanalyse entwickelt. Das Verfahren ermöglicht die simultane Visualisierung von acht verschiedenen Zielproteinen innerhalb einer einzelnen Zelle in einem einzigen Präparationsschritt – und das unter Verwendung konventioneller Mikroskopiesysteme.

Die herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie stößt meist bei drei bis vier parallelen Zielstrukturen an ihre Grenzen. Die emittierten Fluorophore überlappen sich spektral und marktübliche Detektoren besitzen nur wenige Farbkanäle. Dieser neue Ansatz nutzt daher eine zusätzliche physikalische Messgröße zur präzisen Signaltrennung.

Signalunterscheidung über die Fluoreszenzlebensdauer (NanoFLex)

Die neu eingeführte Methode erweitert den Analyseraum um die Dimension der Fluoreszenzlebensdauer. Sie ist benannt als „Nanobody-guided Fluorescence Lifetime Multiplexing“ (NanoFLex). Dabei erfasst man zeitaufgelöst die charakteristische Abklingzeit der Fluorophore im Nanosekundenbereich nach gepulster Laseranregung. „Zwei Marker können farblich identisch aussehen und dennoch klar voneinander getrennt werden, da der eine messbar länger fluoresziert als der meiste. Das ist ein bisschen so, als würde man zwei Instrumente nicht anhand der Tonhöhe unterscheiden, sondern danach, wie schnell der Klang abklingt“, erklärt Prof. Opazo. „Für uns war es wichtig, dass sich die Methode problemlos mit herkömmlichen Lichtmikroskopen umsetzen lässt, die in der Lage sind, die Fluoreszenzlebensdauer zu detektieren. Es ist keine spezielle Mikroskopieplattform erforderlich“, ergänzt Dr. Tsukanov.

Biochemische Steuerung der Abklingkinetik via Proteintaschen und Nanobodies

Die gezielte Modifikation der Fluoreszenzlebensdauer basiert auf der Modulation der unmittelbaren chemischen Mikroumgebung der Fluorophore. Das System nutzt vier genetisch hergestellte Varianten einer spezifischen Proteintasche, die dem gebundenen Farbstoffmolekül jeweils eine definierte Abklingzeit aufprägen. Bei Einsatz eines einzelnen roten Fluorophors kann man so über die vier unterschiedlichen Lebensdauern bereits vier Zielproteine im selben Spektralkanal differenzieren.

Für die routinemäßige Anwendung werden diese Proteintaschen an rekombinante, aus Cameliden stammende Antikörperfragmente (Nanobodies) gekoppelt. Da diese Nanobodies eine im Vergleich zu klassischen Immunglobulinen etwa zehnfach geringere Molekülmasse aufweisen, lassen sie sich präzise als Sekundärreagenzien an primäre Antikörper binden. Über eine Vorkonjugation der Primärantikörper mit den spezifischen Nanobody-Konstrukten vor der Probeninkubation wird eine Ein-Schritt-Multiplex-Markierung des gesamten Target-Panels erreicht.

Katalogisierte Farbstoff-Verfahren und Diagnostisches Potenzial

Im Rahmen der Validierung wurden 26 Farbstoffe in Kombination mit den vier Proteintaschen-Varianten systematisch charakterisiert und in einer Referenzdatenbank zur gezielten Assay-Konfiguration zusammengefasst. Ein wesentlicher Vorteil von NanoFLex zeigt sich bei der Analyse komplexer Gewebeschnitte und Biopsaten. Die typischerweise auftretende Gewebe-Autofluoreszenz lässt sich aufgrund ihrer spezifischen Abklingkinetik mathematisch präzise vom Nutzsignal trennen. Die Kombination aus hoher Target-Dichte pro Färbegang und der Elimination störender Hintergrundsignale prädestiniert das Verfahren für die hochdurchsatzfähige Gewebediagnostik bei limitiertem Probenmaterial. Zukünftige Entwicklungen neuartiger Fluorophore und optimierter Deconvolution-Algorithmen lassen eine weitere Steigerung der Multiplexing-Kapazität erwarten.

Quelle

Universitätsmedizin Göttingen – Georg-August-Universität (09/2026)